Caratterizzazione funzionale di mutazioni in geni associati all'ipertermia maligna e al central core disease e identificazione di loci alternativi per l'ipertermia maligna

L'importanza di una fine regolazione della concentrazione di Ca2+ intracellulare nel muscolo scheletrico è evidenziata anche da un gruppo di malattie neuromuscolari associate a mutazioni nel canale del Ca2+ RyR1, localizzato sulle membrane del reticolo sarcoplasmatico: ipertermia maligna (MH), central core disease (CCD) e multi-mini core disease (MmD). Più del 50% dei casi di suscettibilità all'MH (MHS) sono associati a mutazioni in RyR1. Inoltre, altri 5 loci genici alternativi per l'MHS sono stati individuati (MHS2-6). Mutazioni nel gene CACNA1S (locus MHS5), che codifica la subunità alfa1 del canale del Ca2+ voltaggio-dipendente Cav 1.1 o DHPR, sono state identificate in pazienti MHS. Gli scopi di questo progetto di ricerca sono la caratterizzazione funzionale di mutazioni identificate nel gene RYR1 in pazienti italiani con MHS e con CCD, e di una nuova mutazione identificata nel gene CACNA1S e, inoltre, lo studio del coinvolgimento di altri loci genici potenzialmente associati all'MH in famiglie italiane. Gli studi funzionali sui canali RyR1 mutati saranno effettuati in linfociti B immortalizzati e isolati da pazienti portatori di mutazioni di RyR1 in eterozigosi e da soggetti normali (controlli); saranno valutati due parametri: la velocità di secrezione di protoni e il rilascio di Ca2+ in risposta ad agenti attivatori di RyR1. Inoltre saranno eseguiti studi funzionali di canali DHPR per caratterizzare una nuova mutazione del gene CACNa1S identificata in una famiglia italiana con MH. Miotubi generati da linee cellulari GLT omozigoti disgeniche (alfa 1S knock out) di topo saranno transfettate con costrutti marcati con GFP e codificanti la subunità alpha1S di DHPR sia wild type che mutata. In questi sistemi saranno studiate la cinetica delle correnti elettriche evocate dal Ca2+ e il rilascio di Ca2+ indotto dalla caffeina anche in collaborazione con il Prof. M. Grabner dell'Università di Innsbruck. I risultati che si otterranno dalla caratterizzazione funzionale dei canali del Ca2+ mutati potranno fornire informazioni sull'influenza che una data mutazione ha sul comportamento dei canali RyR1 e DHPR e quindi sulla relazione tra struttura e funzione di queste proteine. Inoltre, lo studio dell'influenza di una determinata mutazione sulla struttura e funzione di questi canali del Ca2+ potrebbe fornire anche un considerevole contributo alla diagnosi. Il coinvolgimento di altri loci genici nella MH sarà valutato in famiglie italiane mediante analisi di linkage con marcatori polimorfici adiacenti ai loci MHS già identificati (MHS2-6). Tale analisi sarà condotta in una famiglia in cui sono state escluse mutazioni nel gene RYR1. Questo progetto contribuirà a chiarire le basi molecolari e l'eziopatogenesi di malattie quali MH e CCD e delle loro distinte caratteristiche patofisiologiche (iperattività muscolare farmaco-dipendente nell'MH e debolezza muscolare e sviluppo di "cores" in CCD e MmD), nonchè i meccanismi responsabili dell'accoppiamento eccitazione - contrazione