Analisi del meccanismo di smistamento di proteine GPI-ancorate in cellule epiteliali polarizzate

Le proteine GPI-ancorate sono arrichite nel dominio apicale nella maggior parte degli epiteli (MDCK, Caco-2, LLC-PK e SK-CO15). A differenza degli altri epiteli, le cellule FRT, derivate da tiroide di ratto Fischer, indirizzano la maggior parte delle proteine GPI endogene alla superficie basolaterale (Zurzolo et al., 1993; Zurzolo et al., 1994). Inoltre in queste cellule diverse proteine GPI trasfettate possono seguire una via differente: PLAP si associa a rafts durante il suo trasporto apicale, mentre gD1-DAF non è incorporata in questi microdomini ed è trasportata basolateralmente (Lipardi et al., 1998; Lipardi et al., 2000; Paladino et al., 2002). Abbiamo, perciò, supposto che l???ancora GPI non fosse sufficiente a determinare lo smistamento apicale, ma caratteristiche dell???ectodominio della proteina potessero avere un ruolo importante nello smistamento apicale. Obiettivo della tesi di dottorato è stato di capire, quindi, quale meccanismo fosse coinvolto nello smistamento apicale di protene GPI-ancorate in modo da riuscire a spiegare le differenze osservate tra le due linee cellulari e tra diverse proteine nella stessa linea cellulare. A tale scopo abbiamo deciso di utilizzare come proteina modello una proteina semplice come la GFP (Green Fluorescent Protein) (Tsien, 1998) a cui è stata fusa un ancora glicolipidica, GFP-GPI. Abbiamo utilizzato due approcci: 1) un approccio di imaging in cellule vive, sfruttando la proprietà di auto-fluorescenza della GFP, 2) un approccio biochimico. Obiettivo del primo approccio è stato quello di analizzare in vivo il traffico intracellulare di GFP-GPI in cellule MDCK e FRT in modo da determinare se vi fosse una differenza nelle due linee cellulari. Abbiamo, inoltre, voluto determinare se le vescicole che trasportano questa proteina alla superficie hanno caratteristiche differenti. L???approccio biochimico, invece, ci ha permesso di dissezionare il ruolo dei microdomini nello smistamento apicale e il coinvolgimento dell???ectodominio della proteina.