Regolazione della NADPH ossidasi non fagocitica mediata dal recettore FPRL1: effetto delle specie reattive dell'ossigeno generate sulla regolazione dell'espressione genica

L'obiettivo di questo studio è stato: i) l' identificazione, in fibroblasti umani IMR90, delle kinasi responsabili della fosforilazione di p47phox e quindi del fine controllo della NADPH ossidasi non fagocitica; ii) l'analisi dell'espressione genica in seguito a modificazioni delle condizioni redox intracellulari indotte dal peptide WKYMVm. Abbiamo innanzitutto analizzato la capacità del peptide W di attivare PKC in cellule IMR90. L'attività di PKC negli estratti totali è stata misurata a 1 e 5 minuti dopo stimolazione dei fibroblasti umani deprivati di siero con 10 micromolare WKYMVm. I risultati hanno dimostrato che l'attività enzimatica, misurata come la capacità di fosforilare un peptide bersaglio contenente siti di fosforilazione di PKC, è rilevabile dopo 1 minuto ed aumenta significativamente dopo 5 minuti di esposizione a WKYMVm. E' stato dimostrato che le PKC attivate stimolano Ras, Raf e le ERK in diversi tipi cellulari e che l'attivazione delle ERK mediante TPA è prevenuta dagli inibitori di PKC. Inoltre, la fosforilazione delle ERK indotta da N-fMLP in neutrofili è inibita da GF109203X e dalla calphostina c. Abbiamo quindi analizzato se isoforme di PKC sensibili a GF109203X e a Go6983 sono coinvolte nella fosforilazione delle ERK in cellule IMR90 stimolate con WKYMVm. I risultati hanno mostrato che la preincubazione con GF109203X, che agisce come inibitore competitivo per il sito di legame all'ATP di PKC, o con Go6983 previene l'attivazione di ERK2 in maniera dose-dipendente. Poichè le PKC convenzionali sono attivate dal calcio e dal DAG mentre le PKC nuove sono calcio-insensibili, abbiamo anche analizzato gli effetti della deplezione del calcio intracellulare sulla attivazione delle ERK. I dati ottenuti hanno rivelato che la preincubazione con il chelante del calcio BAPTA-AM previene significativamente la fosforilazione delle ERKin maniera dose-dipendente. Questi risultati suggeriscono che isoforme di PKC calcio-dipendenti agiscono sulla regolazione della fosforilazione delle ERK, ma non possono escludere che anche isoenzimi di PKC calcio-indipendenti sono coinvolti. Abbiamo inoltre dimostrato che in cellule IMR90 stimolate con il peptide W, la preincubazione con GF109203X o con Go6983 previene la fosforilazione di p47phox e la sua traslocazione sulla membrana. Abbiamo anche analizzato il ruolo dei due inibitori di PKC nella attivazione della NADPH ossidasi mediata da WKYMVm. Membrane purificate da fibroblasti stimolati con il peptide W o preincubati con GF109203X o Go6983 prima della stimolazione, sono stati incubati con le corrispettive proteine citosoliche e cimentate in un saggio di riduzione del citocromo c sensibile alla SOD. I risultati hanno dimostrato che la generazione di superossido NADPH-dipendente è prevenuta dopo trattamento con GF109203X o Go6983. Sono stati successivamente analizzati gli isoenzimi di PKC attivati in seguito all'esposizione a WKYMVm investigando sulla loro compartimentalizzazione cellulare dopo la stimolazione. In risposta al peptide W, delle sette isoforme di PKC che abbiamo analizzato solo PKC-alfa e PKC-delta traslocano dalla frazione citosolica a quella di membrana ed un significativo aumento nelle quantità di queste isoforme nella frazione di membrana è osservabile dopo 1 minuto di trattamento. Poichè PKC-alfa e PKC-delta sono attivate in fibroblasti umani IMR90 stimolati con WKYMVm, si è proceduto ad analizzare gli effetti di Go6976, un inibitore selettivo degli isoenzimi calcio-dipendenti PKC-alfa e PKC-betaI, e della rottlerina, un inibitore selettivo dell'attività enzimatica di PKC-delta, sulla attivazione delle ERK e sulla fosforilazione e traslocazione di p47phox. Esperimenti di western blot ci hanno consentito di dimostrare che la preincubazione con Go6976 o con rottlerina causa una inibizione dose-dipendente della attivazione delle ERK nonchè previene l'assemblaggio della NADPH ossidasi, inibendo la fosforilazione e la traslocazione di p47phox.