Antigeni e Adiuvanti per Vaccini e Immunoterapia

La comprensione dei meccanismi molecolari attraverso i quali l’antigene selezionato svolge il suo ruolo verrà perseguita mediante identificazione degli interattori molecolari attraverso esperimenti di proteomica funzionale. Alcune specifiche linee cellulari saranno “esposte” all’antigene ricombinante espresso con un “tag” secondo diverse modalità (tra cui semplice incubazione, microiniezione con antigene ricombinate, la overexpressione di antigeni fusi a specifici tag ecc). In ogni caso verrà sfruttata l’interazione specifica dell’antigene con i suoi putativi partners proteici mediante esperimenti di pull-down o immunoprecipitazione. Negli esperimenti di pull down, l’antigene ricombinante (esca) verrà immobilizzato su un supporto solido sfruttando l’interazione specifica del tag con un ligando opportuno. L’esca verrà incubata con estratti di proteine di membrana delle cellule bersaglio nelle condizioni sperimentali che favoriscono l’interazione dell’antigene con specifici target cellulari. I componenti proteici specificamente trattenuti dall’esca saranno quindi eluiti e frazionati mediante SDS-PAGE e le bande proteiche identificate utilizzando metodologie di spettrometria di massa tandem LC-MS/MS associata a tools bioinformatici per ricerche in banche dati di proteine. Alternativamente in caso di microiniezioni di prodotti ricombinanti oppure di overespressione dell’antigene indotta nelle linee cellulari oggetto di studio, si potranno impiegare strategie di isolamento dei partners molecolari dell’antigene basate su esperimenti di immunoprecipitazione. In questo caso l’antigene esca sarà espressa in forma ricombinante con un tag peptidico per il quale sono disponibili in commercio buoni anticorpi (ad es. FLAG, HA, Myc, etc.). L’esca, trasfettata o microiniettata nella cellula formerà in vivo il complesso multiproteico interagendo con i suoi partners specifici. Una volta formatosi, il complesso verrà immunoprecipitato utilizzando l’anticorpo specifico per il tag con cui l’antigene è stato espresso. Le proteine costituenti il complesso immunoprecipitato saranno quindi eluite, frazionate mediante SDS-PAGE ed identificate utilizzando metodologie di spettrometria di massa tandem LC-MS/MS e ricerche in banca dati come descritto in precedenza. Le proteine isolate come putativi interattori dell’antigene verranno quindi confermate mediante opportuni esperimenti di co-immunoprecipitazione in vitro. L’identificazione sia di recettori e/o trasportatori specifici di membrana, che di interattori proteici intracellulari potrà suggerire la sequenza di eventi molecolari innescata nelle cellule dopo il contatto con l’antigene