Acquisizione e Interpretazione degli Spettri di Massa EI

INTRODUZIONE Negli ultimi quindici anni, la spettrometria di massa ha compiuto straordinari avanzamenti grazie al continuo accrescimento delle capacità e della facilità d'uso di sorgenti di ioni, analizzatori di massa, rivelatori e computer. Ciò, insieme al costo e all'ingombro contenuti degli strumenti, ha consentito la diffusione della spettrometria di massa, che è presentemente considerata la tecnica standard per risolvere problemi chimici e analitici complessi che sarebbe impossibile affrontare con altre tecniche. Infatti, l'applicazione della spettrometria di massa ha rivoluzionato l'approccio a una varietà di problemi in settori delle scienze di base e applicate (come la biologia, la biochimica, le scienze ambientali, l'industria del petrolio, la produzione industriale di farmaci e altri beni di consumo, la chimica analitica forense, etc…) che condividono l'esigenza quotidiana di identificare rapidamente e attendibilmente tracce di sostanze organiche in campioni con una matrice più o meno complessa. L'utilità pratica della spettrometria di massa è stata enormemente dilatata dall'ifenazione dello spettrometro di massa con un cromatografo e, presentemente, praticamente tutti gli spettri di massa sono acquisiti con un sistema ifenato GC/MS (Gas cromatografia/Spettrometria di massa) o LC/MS (Cromatografia Liquida/Spettrometria di massa). Infatti, ciò consente l'acquisizione degli spettri di massa dei componenti puri di un campione anche molto complesso riducendo a un minimo il lavoro preliminare di preparazione del campione prima che esso sia presentato allo spettrometro di massa. Pertanto, nel presentare la spettrometria di massa è impossibile evitare di introdurre argomenti connessi con la cromatografia. Tuttavia, in questo testo l'attenzione è focalizzata sugli spettri di massa ottenuti con una Sorgente di ioni EI (Electronic Ionization) che sono pressoché invariabilmente acquisiti con un sistema GC/MS. Pertanto, i principali concetti alla base delle separazioni gas cromatografiche e delle problematiche connesse con l'ifenazione di un gas cromatografo con uno spettrometro di massa sono presentati nel Capitolo 3, mentre la cromatografia liquida è, per scelta, praticamente ignorata. Poiché, per acquisire il suo spettro di massa EI, una molecola deve essere volatilizzata nell'iniettore del gas cromatografo (o, più raramente, direttamente nella sorgente di ioni dello spettrometro di massa), la ionizzazione EI è applicabile soltanto a molecole di massa inferiore a circa 1000 u. Cionondimeno, vi sono centinaia di migliaia di molecole che possono essere identificate e quantificate via GC/MS (eventualmente, dopo la loro conversione in surrogati con più convenienti proprietà gas cromatografiche). L'ifenazione di un gas cromatografo con uno spettrometro di massa ha creato valore aggiunto sia alla gas cromatografia che alla spettrometria di massa poiché i dati GC/MS si prestano a una serie di valutazioni che sono impossibili con dati acquisiti con un gas cromatografo provvisto di un rivelatore convenzionale o con uno spettrometro di massa isolato. Molti softwares ad hoc sono stati e continuano a essere specificamente sviluppati per estrarre informazioni chimiche, qualitative e quantitative, dai dati GC/MS in maniera rapida e attendibile. Nell'ultimo decennio, principalmente grazie ai decisivi avanzamenti nella tecnologia degli analizzatori Time of Flight (TOF), l'acquisizione di dati GC/MS ad alta risoluzione si è notevolmente diffusa. Cionondimeno, il cavallo da lavoro della GC/MS è un gas cromatografo, provvisto di una colonna capillare low bleeding, interfacciato con uno spettrometro di massa provvisto di un analizzatore di massa a bassa risoluzione (o, come si suol dire, con la risoluzione posta all'unità di massa) e una sorgente di ioni EI, ad alta efficienza di ionizzazione, che può essere operata con elettroni di energie fra 15 eV e 100 eV. Nel Capitolo 1, che è un capitolo introduttivo, che presenta diversi argomenti che saranno successivamente sviluppati nei capitoli successivi, è, fra l'altro, messo in evidenza che uno spettro di massa EI, acquisito con un analizzatore di massa a bassa risoluzione, contiene un numero minore di informazioni chimiche dirette del corrispondente spettro di massa ad alta risoluzione. Cionondimeno, uno spettro di massa EI a bassa risoluzione, acquisito sotto condizioni controllate, è altamente riproducibile e si presta magnificamente a una procedura di riconoscimento completamente automatizzata che consente di identificare una sostanza dal suo spettro di massa EI in poche decine di secondi. Questa procedura consiste nel confrontare lo spettro di massa di una sostanza incognita, acquisito nel proprio laboratorio, con gli spettri di massa collezionati in una libreria commerciale di spettri di massa EI. La procedura di identificazione di una sostanza incognita, per confronto dello spettro di massa con gli spettri di massa di una libreria commerciale, è la ragione della grande popolarità e diffusione dei sistemi GC/MS a bassa risoluzione e, pertanto, il Capitolo 6 è dedicato all'implementazione, ai vantaggi e alle problematiche connessi con questa strategia di identificazione. Sfortunatamente, poiché la procedura di confronto di spettri di massa EI può essere eseguita, anche da parte di utenti inesperti, con alcuni click del mouse (dopo aver importato lo spettro di massa in softwares commerciali dotati di estese librerie di spettri di massa e degli strumenti necessari per eseguire l'operazione di confronto), la disciplina classica, conosciuta come Interpretazione degli spettri di massa EI, ha subito un ingiustificato declino. L'evento primordiale, da cui deriva lo spettro di massa EI di una sostanza, è la formazione nella sorgente EI di uno ione molecolare, M+•, che è formato dalla molecola neutra, M, per perdita di un elettrone a seguito dell'interazione con un fascio di elettroni ionizzanti di alta energia. Questo primordiale evento, che insieme alle caratteristiche strutturali della molecola neutra, definisce il numero e posizione dei picchi di massa lungo l'asse m/z di uno spettro di massa EI, è presentato e discusso da un punto di vista teorico nel Capitolo 4. I picchi di massa in uno spettro di massa EI corrispondono a frammenti ionici prodotti nella sorgente di ioni EI dalle reazioni di decomposizione allo stato gassoso dello ione molecolare che sono governate dalla struttura chimica di M+• e, quindi, della molecola M. Classicamente, la disciplina di interpretazione, per così dire, ab initio degli spettri di massa EI è fondata sull'idea che, conoscendo la chimica che governa la formazione di ioni nella sorgente EI (i.e., regole di frammentazione), sia possibile, almeno in astratto, ricostruire dai frammenti osservati, la struttura della molecola intera da cui essi sono stati generati. La teoria e le strategie per l'interpretazione degli spettri di massa EI sono state sviluppate negli ultimi decenni dello scorso secolo, dopodiché esse sono rapidamente dileguate dal curriculum degli studenti di discipline chimiche sopravanzate dal semplice approccio computerizzato al riconoscimento di sostanze incognite. Sebbene la procedura di confronto di spettri di massa ne abbia, nella pratica quotidiana, eroso il significato pratico, la disciplina classica dell'interpretazione ab initio dello spettro di massa EI, sulla base di definite regole di frammentazione, ha conservato intatto il suo valore didattico per la sua capacità di mettere a fuoco una serie di problematiche e correlazioni che costituiscono il background chimico della spettrometria di massa (indipendentemente dal tipo di strumentazione con cui uno spettro di massa può essere acquisito). Inoltre, un particolare campo in cui la GC/MS si è guadagnata una posizione importante è la metabolomica, che si può intendere come la disciplina che ha per oggetto l'identificazione di nuovi composti di basso peso molecolare di origine biologica come, per esempio, le piccole molecole sintetizzate da una varietà di microorganismi e non ancora descritte. Infatti, i microorganismi sintetizzano piccole molecole che svolgono una qualche funzione biologica nel loro ciclo vitale e che, pertanto, sono bioattive e possono servire come modelli strutturali per la sintesi e produzione di farmaci e composti utili per l'uomo. Composti che non sono mai stati descritti non sono ovviamente presenti in alcun database e, pertanto, informazioni sulla loro struttura possono essere acquisite, dalla spettrometria di massa, solo attraverso l'interpretazione ab initio del loro spettro di massa. Uno degli scopi di questo testo è, quindi, di sviluppare in maniera comprensibile e logicamente organizzata i temi fondamentali della disciplina classica di interpretazione degli spettri di massa EI, almeno fino al punto ritenuto appropriato per evitare un uso acritico dei numerosi softwares sviluppati per assistere il chimico nel processo di identificazione di una sostanza dal suo spettro di massa. La maggior parte della chimica connessa con le reazioni di frammentazione dello ione molecolare, che hanno luogo nella sorgente EI dopo l'interazione della molecola con gli elettroni ionizzanti, è presentata nel Capitolo 5. Deliberatamente, al fine di enfatizzare le connessioni fra i diversi meccanismi di frammentazione di molecole di classi diverse ed esaltarne la loro comune logica, l'argomento è stato confinato in un singolo capitolo. Pertanto, il Capitolo 5 è piuttosto complesso e contiene un cospicuo numero di schemi di frammentazione, di strutture e di spettri di massa che servono per veicolare i concetti fondamentali. Inoltre, nel Capitolo 5, sono esposte un certo numero di correlazioni di significato strutturale espresse attraverso sequenze di valori numerici (valori di m/z) che sarebbe desiderabile imparare a memoria poiché, in casi favorevoli, consentono, a colpo d'occhio, di attribuire significato chimico alla sequenza di segmenti, dislocati lungo l'asse m/z, da cui è costituito un tipico spettro di massa EI. Tuttavia, i picchi di uno spettro di massa sono collocati nel duplice contesto delle reazioni di frammentazione e dei patterns isotopici degli ioni. Il fondamentale tema dei patterns isotopici associati a molecole, ioni e clusters di atomi e del loro ruolo nella spettrometria di massa è introdotto nel paragrafo finale del Capitolo 1. Pertanto, in generale, il Capitolo 5 non dovrebbe essere letto prima di aver letto il Capitolo 1. Il tema dell'interpretazione dei patterns isotopici degli ioni, esposti in uno spettro di massa, è ulteriormente esteso nel Capitolo 7, che è specificamente orientato all'interpretazione del pattern isotopico dello ione molecolare, da cui si può derivare la formula empirica della sostanza da cui lo spettro di massa EI è stato generato. Il Capitolo 2 tratta, in un certo dettaglio, la teoria alla base del funzionamento dei tre principali tipi di analizzatori di massa (i.e., l'analizzatore di massa a quadrupolo (QMF, Quadrupole Mass Filter), l'analizzatore a trappola ionica (QIT, Quadrupole Ion Trap) e l'analizzatore TOF (Time of Flight) e introduce alcuni dei più popolari arrays di analizzatori di massa (Analizzatore di massa a triplo quadrupolo (QqQ) e Analizzatore di massa Quadrupolo-Time of Flight (QqTOF)) che sono usati nella spettrometria di massa tandem o MS/MS. A una prima lettura, per acquisire almeno un'idea di base dei principi fisici che presiedono al funzionamento di un analizzatore di massa, si può leggere solo la prima parte del Capitolo 2, riguardante la teoria del filtro di massa a quadrupolo. Oppure, si può ritornare successivamente al Capitolo 2 leggendo eventualmente solo la parte relativa al tipo di analizzatore di massa di specifico interesse. Infine, nel Capitolo 8 è tracciata e descritta una strategia sistematica attraverso cui, impiegando le proprie capacità interpretative e un certo numero di strumenti software e databases, dovrebbe essere possibile finalizzare tutte le informazioni raccolte da uno spettro di massa EI e individuare la struttura della sostanza da cui lo spettro di massa è stato generato. Molti degli strumenti e databases necessari per implementare la strategia di riconoscimento descritta nel Capitolo 8 sono resi disponibili gratuitamente attraverso il WEB, con l'eccezione delle librerie di spettri di massa EI che sono prodotti commerciali che possono essere acquistati o dai produttori di strumentazione perla spettrometria di massa o da siti WEB specializzati nella vendita di softwares scientifici (e.g., https://www.sisweb.com/software.htm, SIS, Scientific Instruments Services,). Del resto, i moderni sistemi GC/MS hanno di default, fra le loro risorse software, anche una collezione di spettri di massa EI a 70 eV o una libreria di spettri di massa EI è fra le opzioni disponibili al momento dell'acquisto. Nel Box 8.1 (del Capitolo 8) sono stati raccolti un certo numero di indirizzi WEB per accedere a risorse on line o eseguire il download di applicazioni a cui si fa riferimento nel testo. Il Box 8.1 contiene anche un numero limitato di riferimenti a libri classici, principalmente orientati all'interpretazione degli spettri di massa EI, e ad articoli open source che possono servire sia per espandere vari argomenti oltre i limiti di questo testo sia per ottenere ulteriori riferimenti.