LA MODULAZIONE DELLA APOPTOSI: UN APPROCCIO DI PROTEOMICA FUNZIONALE.

Gli obiettivi di questo progetto sono rivolti all’applicazione di approcci proteomici integrati allo studio a livello molecolare del ruolo di vari effettori coinvolti nella regolazione della cascata apoptotica. Il progetto di ricerca sarà incentrato sul fattore di trascrizione NF-kB, dato il ruolo centrale da esso svolto nell’apoptosi, e si propone di studiare il suo meccanismo di azione in diverse linee cellulari dopo induzione dell’apoptosi con una serie di stimoli diversi. Tuttavia NF-kB non può funzionare da solo; esiste una serie di meccanismi in grado di modulare la sua atiività e che quindi influenzano il destino finale della cellula. La definizione di questi meccanismi costituisce l’obiettivo finale del progetto. Si possono, quindi, delineare tre principali linee di ricerca: la prima mirata ad analizzare il meccanismo con il quale diversi effettori, quali le citochine Th2, i peptidi antimicrobibi e la chinasi Ser/Thr AKT, modulano l’attività di NF-kB. L’effetto di questi fattori sarà studiato in linfociti da soggetti normali ed esposti ai differenti effettori, da pazienti con leucemia linfatica cronica B e linfomi, valutando l’effetto di queste molecole sull’intero proteoma e fosfoproteoma cellulare. Analogamente, poiché un meccanismo di morte cellulare programmata correlato a quello dei mammiferi sembra essere presente anche in lievito, si valuterà l’effetto dell’espressione eterologa di NF-kB in S. cerevisiae sul proteoma globale di lievito. La seconda linea analizzerà l’effetto esercitato da NF-kB sui pathway molecolari che portano all’attivazione trascrizionale di numerosi altri fattori apoptotici, tra cui MnSOD, Bcl-xL, Bcl-2 e FLIP. Se NF-kB contribuisce ad aumentare i livelli di espressione di Bcl-xL, Bcl-2 e AKT attraverso il pathway AKT, cellule transfettate con AKT dominante negativo e senza l’attivazione di NF-kB dovrebbero esprimere livelli più bassi delle proteine anti-apoptotiche. In queste condizioni, si dovrebbe assistere ad una sensibilizzazione di queste cellule all’apoptosi. L’identificazione diretta delle proteine che interagiscono con NF-kB sarà condotta mediante studi di proteomica funzionale utilizzando NF-kB marcata con diversi tag. Le proteine con il tag opportuno potranno essere immobilizzate su di un supporto solido derivatizzato con l’opportuno ligando anti-tag (glutatione, anticorpi anti-FLAG, ioni Nichel, etc…) e incubati con l’intero estratto da linfociti e linfomi. Sarà quindi possibile effettuare un paragone delle proteine che interagiscono con NF-kB in cellule normali e tumorali, evidenziando quindi possibili differenze di comportamento del fattori di trascrizione in linee cellulari maligne. Un’analoga strategia sarà utilizzata per l’analisi di linfociti e linfomi sottoposti a stimolazione con le citochine Th2, IL-4 e IL-10, che posseggono effetto anti-apoptotico. I partner di NF-kB saranno analizzati anche in cellule neuronali da soggetti normali e pazienti AD successivamente allo stimolo della cascata apoptotica con peptidi antimicrobici. Analoghi esperimenti saranno condotti in lievito esprimendo NF-kB ricombinante come proteina di fusione con la GST o con il sistema TAP-tag. Le proteine esca sarranno utilizzate in esperimenti di “GST-pull down” e “TAP-tag”. Questi risultati ci consentiranno di paragonare a livello molecolare i meccanismi di regolazione dell’apoptosi mediati da NF-kB in cellule di lievito e di mammifero. Il terzo aspetto dell’attività di ricerca di questo progetto riguarda l’analisi del meccanismo di azione dei fattori antiapoptotici Bcl-2, Bcl-xL e FLIP in defferenti condizioni. Queste proteine saranno espresse in forma ricombinante con opportuni tag ed utilizzate come esche per analizzare gli specifici partners proteici in linfociti e linfomi. Gli eventuali complessi proteici specifici saranno purificati e le singole componenti proteiche identificate secondo la procedura sopra descritta.