Funzione antiossidante di enzimi chiave coinvolti nella difesa dallo stress ossidativo in un procariota adattato al freddo

Pseudoalteromonas haloplanktis è un eubatterio psicrofilo isolato dal mare antartico, in grado di crescere nell’intervallo di temperatura tra 4 e 20°C. Sono già numerose le ricerche condotte su proteine isolate da P. haloplanktis. Inoltre si conosce la sequenza dell’intero suo genoma e sono state descritte alcune applicazioni biotecnologiche delle sue macromolecole. L’ambiente marino freddo in cui cresce questo eubatterio suggerisce un approfondimento sul suo adattamento alla protezione dalle specie reattive dell’ossigeno (ROS). Infatti, la difesa dai ROS in P. haloplanktis è complicata dal fatto che le basse temperature del mare favoriscono la solubilità dell’ossigeno ed aumentano la stabilità dei ROS. D’altra parte nel genoma di P. haloplanktis mancano alcuni geni per la produzione endogena di ROS. Il primo ROS generato dal consumo di ossigeno è l’anione superossido e l’enzima chiave per la sua eliminazione, la superossido dismutasi (SOD), è presente ed altamente efficiente. La difesa dai ROS in P. haloplanktis non comprende però solo una difesa diretta, come quella della SOD, ma anche una protezione indiretta, come ad esempio quella esercitata dal sistema della tioredossina, preposto al mantenimento delle proteine cellulari nel loro stato ridotto. Inoltre gli effetti deleteri dei ROS potrebbero essere controllati anche da altri componenti del metabolismo dello zolfo, che comprendono piccole molecole, come ad esempio il glutatione. Con questo progetto s’intende studiare l’adattamento al freddo di alcuni sistemi enzimatici di P. haloplanktis, preposti alla difesa dalle specie reattive dell’ossigeno (ROS). Il primo enzima oggetto di studio è la Fe–SOD da P. haloplanktis (PhSOD) che, da ricerche pregresse eseguite presso questa Unità, si era dimostrata dotata di un’elevata attività specifica anche a basse temperature. Essa inoltre è molto sensibile all’inattivazione da perossinitrito e contiene un unico residuo di cisteina (Cys57), molto reattivo nei riguardi di reagenti sulfidrilici. Con tale progetto si studierà la regolazione della funzione antiossidante della PhSOD in seguito a modificazioni covalenti su specifici residui dell’enzima. In particolare si cercherà di capire se l’inattivazione della PhSOD causata dal perossinitrito è dovuta alla nitrazione di uno secifico residuo di tirosina. Inoltre si cercherà di identificare tioli cellulari in grado di reagire con la Cys57. A tal riguardo in altri gamma–proteobatteri il più abbondante tiolo cellulare è il glutatione che forma disolfuri misti con le cisteine proteiche, regolandone in tal modo le funzioni. Il glutatione inoltre è presente nella sua forma ridotta e ossidata ed il rapporto tra queste forme regola il potenziale redox cellulare; esiste anche una forma nitrosilata, derivante dalla reazione del glutatione con ossido nitrico. Pertanto si cercherà di evidenziare se la Cys57 della PhSOD è soggetta ad una reazione di S–glutationilazione, individuando quale delle forme del glutatione causa la formazione del disolfuro misto e se la modifica covalente regola le funzioni dell’enzima. L’altro sistema enzimatico oggetto di studio in P. haloplanktis è quello della tioredossina, costituito da tioredossina (PhTrx) e tioredossina riduttasi (PhTrxR). Queste due proteine saranno ottenute in forma ricombinante ed in particolare fuse ad un peptide contenente sei istidine, utile per la purificazione dei prodotti di espressione. La loro caratterizzazione riguarderà il contenuto delle cisteine totali e di quelle libere, nonché la presenza del coenzima flavinico e l’organizzazione come omodimero della PhTrxR. Si passerà poi allo studio delle proprietà biochimiche delle due proteine, valutando anche l’attività combinata di PhTrxR e PhTrx nel sistema completo della tioredossina, comprendente NADPH come donatore di elettroni e insulina umana come susbstrato, anche al fine di determinare il potenziale di riduzione del sistema e la reversibilità della reazione redox. Si valuterà infine la termofilicità ed i parametri cinetici ed energetici di tutte le reazioni, nonché la termostabilità delle proteine mediante profili di inattivazione e denaturazione termica. L’ultimo aspetto della ricerca riguarda il ruolo del glutatione nella regolazione del potenziale redox di P. haloplanktis. Si cercherà di evidenziare la presenza di questo tripeptide in cellule di P. haloplanktis cresciute in diverse condizioni sperimentali, che includono anche stress ossidativo. Il glutatione sarà evidenziato sia in maniera diretta, sia attraverso l’identificazione di proteine glutationilate negli estratti proteici. Inoltre si valuterà se la glutationilazione riguarda, oltre alla PhSOD, anche i componenti del sistema della tioredossina. Pertanto tale progetto verificherà l’adattamento al freddo di SOD e Trx/TrxR durante il controllo dell’omeostasi redox di un microrganismo psicrofilo e se la funzione antiossidante di tali proteine è regolata dalla reattività di specifici gruppi sulfidrilici.