Caratterizzazione strutturale e funzionale di un enzima ADP-ribosilante da S. solfataricus

Dal Sulfolobus e’ stato purificato un enzima ad attivita’ ADPribosilante, termofilico e termostabile, con un optimum di temperatura di 80°C, che condivide con le PARP alcune proprieta’. E’ in grado di cross-reagire con anticorpi diretti contro il sito catalitico di PARP-1, ma non contro il N-terminale, il DNA binding domain, catalizza la reazione di allungamento del ADPR , a formare oligomeri di 5-6 unita’ di adpribosio, interagisce con il DNA. Queste proprieta’ , comuni nelle PARP eucariotiche, rendono particolare l’enzima archeobatterico, essendo questo il primo caso descritto di un’attivita’ poli-adpribosilante di origine procariotica. Questo ci ha portato a dedicare la gran parte delle energie allo studio degli aspetti funzionali dell’enzima e siamo partiti proprio dall’analisi delle proprieta’ di interazione con il DNA. Il DNA di Sulfolobus e’ altamente instabile a temperature superiori a 60°C. La presenza del termozima stabilizza il DNA genomico, aumentandone la Tm; inoltre ha un effetto di protezione in presenza della nucleasi. Dia 47 Analoghi risultati sono stati ottenuti con un plasmide circolare: in presenza dell’enzima, incremento della Tm, formazione di complessi stabili, resistenti alle alte temperature , all’azione di detergenti e delle nucleasi, ma non quando l’enzima e’ degradato dalla proteinasi k. L’attivita’ enzimatica e’ influenzata dal DNA, soprattutto dal genomico. E’ meno sensibile alla forma lineare del plasmide. I risultati ottenuti ci hanno permesso di stabilire che l’enzima lega il DNA con alta affinita’ , ma non specificamente, con una frequenza di 1 molecola di proteina ogni 10 basi. Tra gli accettori proteici e’ una proteina di 7 kDa, la Sso7, che dopo purificazione e’ stata utilizzata per esperimenti di ricostituzione in vitro, sia in forma nativa che ADPribosilata. Qui e’ possibile vedere anche la forma automodificata dell’enzima. La SSo7 rappresenta una famiglia di proteine molto abbondanti in Sulfolobus, ricche in amminoacidi basici, con un motivo strutturale che ricorda le HMG eucariotiche e che hanno la funzione di condensare il DNA. A differenza degli Euriarcheota, i crenarcheota non posseggono proteine di tipo istonico. La disponibilita’ della SSo7 in forma purificata ci ha permesso di condurre una serie di analisi volte a stabilire come variassero le proprieta’ di legame al DNA della SSo7 in forma ADPribosilata. L’attivita’ enzimatica si incrementa di 4 volte in presenza dell’accettore. Quindi la proteina SSo7 rappresenta un accettore di ADPribosio. La conseguenza della modificazione e’ evidente dalle curve di fusione. La SSo7 nativa sposta la Tm del DNA verso le alte temperature, mentre la sua forma ADPribosilata destabilizza considerevolmente l’acido nucleico. In questa direzione sono anche i risultati delle analisi di dicroismo circolare: l’effetto condensante il DNA della proteina basica si traduce in evidente rilassamento dell’acido nucleico se la proteina e’ in forma ADPribosilata. Sulla base di questi risultati si potrebbe ipotizzare un ruolo della PARP di sulfolobus nel rimodellamento della cromatina, ma ancora molto c’e’ da chiarire , soprattutto su come si inserisce questo tipo di regolazione nel contesto dei meccanismi di condensazione del DNA ad oggi dimostrati per gli Archaea.