Attività antitumorale di una Manganese Superossido Dismutasi ricombinante (rMnSOD) o del suo peptide leader coniugato a chemioterapici (rMnSOD-Lp) su cellule leucemiche

La leucemia linfoblastica acuta(LLA) è la neoplasia pediatrica più frequente. Sebbene molti progressi siano stati fatti ancora oggi il 30% va incontro a ricadute dopo un primo trattamento. Le basi molecolari della farmacoresistenza non sono ancora del tutto note.Dati recenti indicano che l’upregulation di Bcl-xL,Erk1 e AKT attivate possa essere associata alle neoplasie ematologiche (1). Di recente è stata isolata un'isoforma della Manganese Superossido Dismutasi (rMnSOD)con funzione oncosoppressiva, facilmente iniettabile ed in grado di essere internalizzata in tutte le cellule, normali e tumorali dove, trasforma i radicali liberi in H2O2. Solo le cellule normali possono convertire il perossido in ossigeno molecolare ed acqua, mentre quelle tumorali ,carenti di catalasi, muoiono per apoptosi Anche nelle leucemie è stata osservata una carenza di catalasi.La proteina rMnSOD è risultata protettiva per le cellule e tessuti normali e citotossica per quelle tumorali(2). Essa entra nelle cellule attraverso il suo peptide leader, non clivato,che costituisce perciò il suo carrier molecolare. Studi recenti effettuati su cellule di carcinoma ovarico, mammario e polmonare utilizzato come carrier coniugato al cisplatino, mostrano che le cellule muoiono per apoptosi rapidamente. Obiettivi 1) Valutare la capacità della rMnSOD o del peptide carrier coniugato al cisplatino o alla epirubicina di essere internalizzati nei blasti leucemici di bambini affetti da LLA e di svolgere una funzione citotossica, come dimostrato su linee tumorali 2) Valutare la modulazione del livello d’espressione di alcuni geni coinvolti nella regolazione dell'apoptosi quali Bax, Bcl2, Bcl-xL e la fosforilazione di AKT e ERK1 prima e dopo trattamento con peptide-cisplatino, peptide-epirubicina e rMnSOD. Materiali e Metodi I blasti leucemici sono stati separati da sangue midollare di bambini affetti da Leucemia Linfoblastica Acuta (LLA) B(n°4) e T (n°4)e 1 campione di linfoma non Hodgkin leucemizzato. Le cellule sono state coltivate in RPMI, FBS 10% e PENSTREP 1%. I test di vitalità utilizzati sono:Trypan Blue e Saggio MTT. Con tecniche immunocitochimiche è stata valutata la internalizzazione delle molecole mediante l’uso di un anticorpo policlonale diretto contro la sequenza del peptide leader della rMnSOD sia in M.O che al TEM. L'analisi quantitativa delle proteine è stata effettuata mediante Western Blotting. Risultati:I dati ottenuti al M.O. e TEM evidenziano una marcata positività citoplasmatica che dimostra l'ingresso del peptide-cisplatino,peptide-epirubicina e della sola proteina rMnSOD nelle cellule leucemiche. L’analisi molecolare sulle cellule leucemiche trattate in vitro in presenza della rMnSOD indica chiaramente che essa esplica un effetto citotossico in maniera dose-dipendente, inducendo l’apoptosi nelle cellule. In particolare nei blasti leucemici di pazienti ad alto rischio e di linfoma leucemizzato ,clinicamente chemioresistente ,provoca una significativa modulazione del gene Bax, principale responsabile del processo apoptotico. La fosforilazione di AKT non sembra essere influenzata dal trattamento con rMnSOD mentre quella di ERK1 è attivata dopo trattamento con rMnSOD nelle LLA a cellule B a basso rischio. Conclusione. Le osservazioni preliminari ottenute in questo studio lasciano ipotizzare un possibile impiego della rMnSOD e del peptide leader quale veicolo piu' efficace di citostatici nel trattamento delle LLA pediatriche. Inoltre l'impiego di citostatici con dosaggi farmacologici minori potrebbe condurre ad una terapia più specifica, selettiva e priva di effetti collaterali.